世界杯买球注册|官方网站-App Store

当前位置:首页 / 新闻动态 / 科研进展 / 正文

科研进展

Science Advances| 郑三多实验室揭示GPCR激活G蛋白的分子基础

发布时间:2022/06/13

G蛋白偶联受体(GPCR)作为细胞膜上的鸟苷酸交换因子(GEF),被配体激活后发生构象变化与G蛋白三聚体(α,β和γ亚基)结合,使Gα亚基本来结合的二磷酸鸟苷(GDP)发生解离,随后细胞质中三磷酸鸟苷(GTP)与Gα亚基结合,导致G蛋白三聚体解离为Gα亚基和Gβγ亚基。这一过程使得G蛋白变成激活状态 (结合GTP的Gα亚基和解离的Gβγ亚基),并参与下游的信号传递。

结构生物学对于理解GPCR激活G蛋白的分子机制至关重要。冷冻电子显微镜技术的发展将结构生物学和生物化学带入一个新的时代,该技术也为GPCR-G蛋白复合物的三维结构研究提供了极大的便利。然而以往的结构生物学研究主要解析了在没有GDP或者GTP结合状态下GPCRG蛋白复合物的结构,这种状态代表一个在体内存在时间极短但体外稳定的中间状态。因为GPCRG蛋白复合物在体外GDP/GTP存在情况下很不稳定,所以一直缺乏在GDP/GTP结合状态下的高分辨率结构,因此人们对G蛋白激活的机制的理解仍然不全面。

2022年610日,世界杯买球注册/清华大学生物医学交叉研究生院郑三多实验室在Science Advances杂志上发表题为“Structural insights into G protein activation by D1 dopamine receptor”。该研究通过冷冻电镜手段解析了D1多巴胺受体(D1R)和Gs复合物在不结合核苷酸、结合GDP、结合GTP等三种状态下的结构,揭示GPCR激活G蛋白的分子基础。

首先为了提高D1RGs复合物在GDP/GTP存在情况下的稳定性,首先研究人员使用了截断的Gαs亚基 (mini-Gαs),该截断体含有结合核苷酸的Ras-like GTPase结构域,缺少了AHD结构域,其次通过融合蛋白手段将D1RC末端与mini-GαsN端连接。通过比较这三种状态下的结构 (图1),研究人员发现在G蛋白激活过程中,多巴胺的结合构象是动态变化的,这种变化主要是由于D1RG蛋白结合界面构象的变化导致的。这些结构反映了GPCR的构象以及GPCRG蛋白偶联的动态变化过程。


图1

1:多巴胺受体/G蛋白复合物在未结合核苷酸,结合GDP和结合GTP结合状态下多巴胺的结合模式和结合配体口袋构象的差异。


D1R被多巴胺激活后发生构象变化与结合GDPG蛋白三聚体结合,它们的结合导致G蛋白C末端的α5螺旋为了插入GPCR内部发生旋转平移的构象改变(图2A-2C),α5的构象与不结合核苷酸的D1R-Gs结构和以往解析的GPCR-G蛋白复合物的构象一致。α5的构象变化引起Gα亚基核苷酸结合口袋的残基V367远离GDP,减弱了GDP的结合能力。此外V367的移动也削弱了Ras-like结构域和AHD 结构域的相互作用(图2D2E),这两个结构域的分离对于GDP的解离至关重要。另外值得注意的是Gα亚基Ras-like结构域中Q59的旋转与AHD结构域形成空间位阻,也进一步促进Ras-like结构域和AHD结构域的分离(图2F)。为了验证结构发现,研究人员利用GTP 交换实验来比较多巴胺受体对G蛋白野生型和突变体的激活程度。和预期结果一致,V367AQ59L突变显著增强G蛋白的交换速率(图2G)。


图2

2:多巴胺受体与Gs复合物在GDP结合状态下构象变化揭示GPCR导致Gα亚基中GDP解离的分子机制。


随着GDP的解离,GTP结合到Gα亚基上。研究人员经过三维分类方法获得了D1R‒Gs复合物与GTP结合的两个不同构象,一个缺失Nb35,一个结合Nb35Nb35主要用于稳定GPCR-G蛋白的复合物,但是GTP的结合使得Nb35与复合物脱离。在缺失Nb35的结构当中,GTP的结合引起Gα亚基中switch II构象改变,进而导致Gα亚基中αNGβγ相互作用界面的破坏,最终引起αN朝向受体上翘20° (图3A-3F)。αN的构象变化在以往所有解析的GPCR-G蛋白复合物结构中都没有观察到,但是以前的生物物理和生物化学研究结果表明αNG蛋白激活过程中发生明显构象变化。为了进一步证明结构发现,研究人员通过突变破坏αNGβγ的相互作用界面模拟激活过程中αN的上翘,发现受体丧失对G蛋白的招募能力 (图3G)。同样,在αN-β1 hinge处的一对氢键相互作用在GDP状态下存在,在GTP状态下由于构象变化消失。当通过突变破坏这对氢键相互作用时发现,G蛋白的招募不受影响,但G蛋白的解离速率明显加快 (图3H-3J)。


图3

3:多巴胺受体/G蛋白复合物GTP结合状态构象变化。


综上所述,该研究通过对多巴胺受体G蛋白复合物在未结合核苷酸状态,结合GDP状态和结合GTP状态结构的解析,发现GDP结合状态是处于结合受体之后GDP释放之前的中间状态,表明V367和α1螺旋的构象变化对起始GDP释放是关键的。GTP结合状态的结构发现switch II构象改变和αN的上翘是GTP引起受体G蛋白解离的结构基础 (图4)。


图4

4D1R激活G蛋白模型。


郑三多实验室的博士研究生滕霄,陈思嘉为本文共同第一作者,其他作者包括郑三多实验室技术员王晓莹、黄牛博士和黄牛实验室的博士研究生王情、陈钊。郑三多博士为本文通讯作者。该研究由科技部、北京市政府和清华大学共同资助。

论文链接:https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abo4158


XML 地图